• header
  • header
  • header
  • header
  • header
  • header
  • header
  • header
  • header
ВЕТЕРИНАРНАЯ КЛИНИКА "АВЕРС"
круглосуточно
+7 (495) 989-7747
наши новости
Все новости

Островковые клетки поджелудочной железы плодов кролика: получение и предпосылки для клинического применения

29-12-2014

Введение

Инсулинозависимый сахарный диабет является тяжелейшим заболеванием, вследствие повреждения островковой ткани поджелудочной железы и сопровождается абсолютной инсулиновой недостаточностью с выраженной гипергликемией и сопутствующими осложнениями в виде ангио-, нефро-, и ретинопатий.

Трансплантация в организм больного инсулинозависимым сахарным диабетом культуры островковых клеток поджелудочной железы является перспективным способом достижения гликемического контроля, поступления эндогенного инсулина, предотвращения тяжелых гипогликемий и сопутствующих осложнений[10].

Материалом для трансплантации b-клеток поджелудочной железы могут служить клетки, как животных одного вида (например, собака→ собака (аллотрансплантация)), так и разных видов (кролик→собака, (ксенотрансплантация)).

Использование кролика, как источника островковых клеток для трансплантации определяется не только биодоступностью материала, но и позволяет получать значительное количество трансплантируемых клеток. 

В НИИТиИО проф. Скалецкий Н.Н. и соавт. [3] разработали способ получения культур из неонатальной поджелудочной железы кролика.  Как отмечают акад. В.И. Шумаков и соавт. [5], использование в качестве источника островковых клеток поджелудочной железы кроликов позволило значительно увеличить количество клинических трансплантаций. К 1994 г. было выполнено более 800 алло- и ксено-трансплантаций культур островковых клеток (в том числе культур плодных островковых клеток человека, культур островковых клеток плодов крупного рогатого скота, свиньи и культур, полученных из поджелудочной железы новорожденных кроликов). Кроме того, за пределами НИИТиИО сотрудниками этого учреждения было осуществлено еще около 200 пересадок (все — ксенотрансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов).

Одним из самых перспективных направлений в трансплантации островковых клеток  является поиск иммунологически привилегированных зон для трансплантации. Это позволяет достигать длительного функционирования трансплантированных ксеногенных b-клеток без назначения иммунодепрессантов. При этом отмечается, что наиболее подходящими зонами для трансплантации островковых клеток являются тимус, семенники, костный мозг, почки, печень [2, 8, 10, 12].

Трансплантация b-клеток в печень признается наиболее эффективной многими авторами [6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20]. Объясняется это «родственностью» этих тканей в эмбриогенезе, своё начало они берут от одного типа стволовых клеток. Кроме того, в последних работах по получению и дифференцировке стволовых клеток протокового эпителия поджелудочной железы показана дифференцировка этих клеток не только в b-клетки и ацинарную ткань поджелудочной железы, но и в овальные клетки печени [13].

В данной экспериментальной работе нами исследовалась перспектива использования ксеногенной культуры островковых клеток, полученной из поджелудочных желез плодов кролика, для обеспечения поступления инсулина в организм мышей с экспериментальным (стрептозоциновым) сахарным диабетом.

Материалы и методы

Животные. В работе были использованы мыши породы BALB/c весом 25-30 г., самки в количестве 30 голов (РОНЦ РАМН). Все эксперименты проводились согласно требованиям Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Все животные содержались на базе вивария РОНЦ РАМН. Лабораторный диабет у мышей вызывали внутривенным введением  стрептозоцина (Sigma, # S 0130) в дозе 65 мг/кг веса. Через 10 дней после введения стрептозоцина производили контроль гликемии в крови глюкометром (Accu-Chek Active, Roshe) и при уровне глюкозы выше 10,0 ммоль/л производили  ксенотрансплантацию культуры фетальных островковых клеток. Две мыши к этому сроку погибли от гипергликемии. Все животные были разделены на 3 группы:

  1. Здоровые животные без трансплантации (10 гол.) – «Контроль»;
  2. Животные с лабораторным диабетом без трансплантации (9 гол) – «Диабет»;
  3. Животные с лабораторным диабетом с трансплантацией b-клеток (9 гол.) – «Трансплантация».

Получение и культивирование фетальных островковых клеток. Фетальные островковые клетки кролика выделяли из плодов 25-30 сут. развития. Материал для выделения получали в питомнике по выращиванию кроликов ООО «Алькона» пос. Дубровицы, Московской обл. Поджелудочные железы плодов стерильно извлекали, измельчали и  инкубировали в среде 199 с добавлением 1,5 мг/мл коллагеназы (Sigma, # C-0130). После этого суспензию клеток пипеттировали и переносили в культуральные флаконы (Corning), содержащие среду 199 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки культивировали в течение 7-10 дней до трансплантации. При этом клетки проверялись на бактериальную, вирусную и микоплазменную загрязненность. Кроме того, данные клетки тестировались нами на туморогенность in vitro по характеру роста культуры и in vivo на иммунодефицитных мышах.

Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание клеток.  Цитохимическое окрашивание b-клеток на инсулин проводили альдегид-фуксином по методу Гомори. Иммуноцитохимию осуществляли с использованием первичных антиинсулиновых мышиных антител (Sigma, # I-2018) и вторичных антивидовых антител, меченных FITC (Sigma, # F-8771). Детекцию окрашенных клеток проводили на флуоресцентном инвертированном микросокпе Olympus.

Трансплантация. Перед трансплантацией клетки отмывали от питательной среды и сыворотки, снимали с культурального пластика, центрифугировали и ресуспендировали в физиологическом растворе и помещали в инсулиновый шприц из расчёта 106 кл/0,5 мл раствора на животное.

Под общей анестезией (рометар, золетил) мышам делали лапаротомию и интрапаренхиматозно вводили суспензию клеток (3 инъекции иглы на печень). После этого мышечный и кожный слои раны ушивали. Оценку эффективности трансплантации оценивали измерением уровня глюкозы в крови глюкометром (Accu-Chek Active, Roshe) на 1, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 дни после трансплантации.

Результаты

В результате проведенных исследований нами была получена культура b-клеток плодов кролика, представляющая популяцию мелких, округлых клеток, плотно упакованных в кластеры различного размера, свободно плавающих в суспензии, либо прикрепляющихся к субстрату (Рис.1, 2). 

Островковые клетки поджелудочной железы плодов кролика: получение и предпосылки для клинического применения

Рис.1.  b-клетки плода кролика, 5 сут. культивирования. Нативный препарат. Ув.х100

Островковые клетки поджелудочной железы плодов кролика: получение и предпосылки для клинического применения

Рис.2.  b-клетки плода кролика, 10 сут. культивирования. Нативный препарат. Ув.х100

Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание показало высокое содержание инсулина в цитоплазме этих клеток (Рис.3).

Островковые клетки поджелудочной железы плодов кролика: получение и предпосылки для клинического применения.

 

Рис.3. Иммуноцитохимическое окрашивание бетта-клеток на инсулин.Краситель FITC. Ув.х100

После внутривенного введения стрептозоцина у всех мышей (20 гол.) развились характерные признаки диабетического статуса: полифагия, полидипсия, полиурия, выпадение шерсти, похудание, гиподинамия. Две мыши при этом погибли.

 Определение содержания глюкозы в крови через 10 дней после введения стрептозоцина, показало, что у всех 18 оставшихся живых мышей уровень глюкозы был значительно выше нормы и превышал показатель 10 ммоль/л, позволяющий говорить о стойкой гипергликемии. После трансплантации в печень суспензии фетальных b-клеток (Группа 3) отмечалось ослабление клинических признаков диабета. Измерение уровня глюкозы показало значительное снижение уровня глюкозы  в течение 14 дней до показателей нормы.

В второй группе (животные с экспериментальным диабетом без трансплантации) отмечалось ухудшение общего состояния животных, нарастание всех признаков диабета, стойкая гипергликемия (20-35 ммоль/л) и гибель всех животных (9 гол.) в течение 6 дней.

В контрольной группе (Группа 1) все животные были без изменений и анализ крови показывал стойкую нормогликемию этих животных (2,8-5,2 ммоль/л).

Динамика изменений средних значений уровня глюкозы в экспериментальных группах отражена в таблице 1 и диаграмме 1.

Табл.1

Показатели глюкозы в экспериментальных группах, ммоль/л

Группы

Суток после трансплантации

-1

1

3

7

14

21

28

35

42

49

56

Контроль

3,7±0,3

2,8±0,2

3,4±0,3

3,1±0,4

4,1±0,4

3,6±0,3

3,8±0,2

2,9±0,3

3,7±0,4

3,7±0,3

3,4±0,3

Диабет

12,3±0,5

17,3±0,7

22,8±0,3

38,2±0,5

пали

-

-

-

-

-

-

Транспланта­ция

11,8±0,5

13,3±0,8

10,5±0,7

8,8±0,6

5,4±0,3

4,2±0,7

4,3±0,4

3,9±0,3

3,8±0,5

4,1±0,4

3,9±0,4

Островковые клетки поджелудочной железы плодов кролика: получение и предпосылки для клинического применения

Диаграмма 1

Заключение

Таким образом, анализ данных мировой литературы и наши эксперименты показали, что b-клетки плодов кролика в культуре формируют гомогенную популяцию клеток, активно экспрессирующих инсулин. Показано, что трансплантация культуры фетальных кроличьих b-клеток животным с экспериментальным сахарным диабетом позволяет добиться снижения уровня сахара в крови и его нормализации на протяжении всего срока наблюдения (60 дней) без введения экзогенного инсулина. Кроме того, нормализация уровня глюкозы после трансплантации происходит без применения каких- либо иммунодепрессантов. Опыты показали, что прокультивированные и очищенные островковые клетки плодов кролика могут быть использованы для ксенотрансплантации животным при лечении инсулинозависимого сахарного диабета.  

Литература

  1. Дедов И.И., Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Современные аспекты трансплантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете. 3-й Всероссийский диабетологический конгресс, 2004г., Москва.
  2. Леонович С.И., Слука Б.А., Игнатович И.Н., Горанов В.А., Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы в красный костный мозг. Белорусский медицинский журнал.- 2004. -№1.- с.44.
  3. Скалецкий H. H., Кирсанова Л. А., Блюмкин В. Н., В кн.: «Проблемы трансплантологии и искусственных органов», М. - 1994. - стр.73-80
  4. Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Игнатенко С. Н. И др. Пробл. Эндокринол. - 1985. - №5. - стр.67-70
  5. Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Скалецкий Н. Н. и др., Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. Москва. -Канон.- 1995.-384с
  6. Alejandro R., Caulfield A., Fround Т. et al., Cell Transplant. - 2001. - Vol. 10.-P. 520
  7. Alejandro R., Ferreira J. V., Caulfield A. et al., Am J Transplant. - 2002. -Vol. 2. - Suppl. 3. - P. 227
  8. Berney T., Bühler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langerhans: new developments. Swiss. Med. Wkly 2002; 132:671-680
  9. Bretzel R.G., Manus E., Schomber C. The liver as a site for implantation of islets of Langerhans in experimental diabetes. Morphologic and metabolic observation. “Acta Endocrinol.”, 1978, 87, Suppl.215, 69.
  10. Federlin K., Pozza G. Indications for clinical islet transplantation today and in the foreseeable future – the diabetologist`s point of view. J Mol Med 1999;77:148-152
  11. Henryk Zulewski, Elizabeth J. Abraham, Melissa J. Gerlach, et al. Multipotential Nestin-Positive Stem Cells Isolated From Adult Pancreatic Islets Differentiate Ex Vivo Into Pancreatic Endocrine, Exocrine, and Hepatic Phenotypes. Diabetes, Vol. 50, March 2001
  12. Kolb E., Largiader F. Clinical islet transplantation. “Transpl. Proc.”, 1980, 12, №4, 205-207
  13. Lechner A. Habener J. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus. AJP-Endocrinol Metab • VOL 284 • FEBRUARY 2003.
  14. Najarian J.S., Sutherland D.E.R. et al. Human islet autotransplantation. A preliminary report. “Transplant. Proc.”, 1977, 9, №1, 233-236.
  15. Nielsen J., Svensson C., Galsgaard E. Beta cell proliferation and growth factors. J Mol Med (1999) 77:62–66
  16. Oberholzer et al. ß Cell Replacement for the Treatment of Diabetes. Annals of the New York Academy of Sciences 944:373-387 (2001)
  17. Richardt M., Menden A., Bretzel R. Islet transplantation in experimental diabetes of the rat. Hormone and metab. Res., 1984, 16, №10, 551-552.
  18. Shapiro A. M., Lakey J. R., Ryan E. A. et al., N. Engl. J. Med. - 2000. -Vol. 27. - P. 230-238
  19. Song K, et al. In vitro transdifferentiation of adult pancreatic acinar cells into insulin-expressing cells. Biochem Biophys Res Commun 2004; 316: 1094–1100
  20. Valente U. Ferro M. Barocci S. Report of clinical cases of human fetal transplantation. “Transplant. Proc.”, 1980, 12, №4, 213-214
  21. Vijayakumar K. RamiyA, Michael Maraist et al., Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells. Nature Medicine • Vol. 6 • Number 3 • March 2000.
  22. Berney T., Bühler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langerhans: new developments. Swiss. Med. Wkly 2002; 132:671-680
наши новости
Все новости
Ветклиника АВЕРС входит в состав Национальной Ветеринарной Палаты